식품의약품안전청 공고 제 2002 -    호

생물학적제제기준및시험방법을 개정함에 있어 국민에게 미리 알려 의견을 듣고자 그 개정취지와 주요내용을 행정절차법 제41조의 규정에 의하여 다음과 같이 공고합니다.

2002년  1월   일

식품의약품안전청장

생물학적제제기준및시험방법중개정(안) 입안예고

1. 개정이유

생물학적제제기준및시험방법을 제제의 특성과 국제적인 흐름에 맞게 개정하려는 것임

2. 주요골자

가. 생물학적제제 각조 중 □헤모필루스 인플루엔자 비형·디프테리아 씨알엠(CRM197) 단백 접합 백신□의 검정항 중 역가시험 삭제

나. 생물학적제제 각조 중 □헤모필루스 인플루엔자 비형·파상풍톡소이드 접합 백신□의 역가시험 및 무독화시험 삭제

다. 생물학적제제 각조 중 □인터페론 알파-2a 주사액(유전자재조합)□  원액 또는 최종원액의 무균시험항 및 이상독성부정시험항 개정

다. 생물학적제제 각조 중 □주사용 건조 인터페론 알파-2a(유전자재조합)□의 원액 또는 최종원액의 무균시험항  및 이상독성부정시험항 개정

마. 생물학적제제 각조 중 □주사용 건조 인터페론 알파-2b(유전자재조합)□ 원액 또는 최종원액의 무균시험항 및 이상독성부정시험항 개정

바. 생물학적제제 각조 중 □인터페론 알파-2b 주사액(유전자재조합)□의 이상독성부정시험항 개정

사. 생물학적제제 각조 중 □주사용 건조 인터페론 감마(유전자재조합)□의 원액 또는 최종원액의 무균시험항 개정

3. 의견제출

이 개정(안)에 대하여 의견이 있는 단체 또는 개인은 2002. 1.  .까지 다음 사항을 기재한 의견서를 식품의약품안전청장(참조 : 세균제제과장, 주소 : 서울특별시 은평구 녹번동 5, 전화 : 02-380-1745, 팩스 : 02-383-8322)에게 제출하여 주시기 바라며, 더 자세한 내용을 알고 싶으신 분은 식품의약품안전청 홈페이지(http://www.kfda.go.kr)를 참고하시기 바랍니다.

가. 예고사항에 대한 항목별 의견(찬·반 여부와 그 이유)

나. 성명(단체의 경우 단체명과 그 대표자 성명), 주소 및 전화번호

다. 기타사항

식품의약품안전청 공고 제2002 - 3호

생물학적제제기준및시험방법중개정(안)

2002년 1월 7일

식품의약품안전청장

생물학적제제기준및시험방법중 다음과 같이 개정한다.

생물학적제제 각조 중 헤모필루스 인플루엔자 비형 ·디프테리아 싸알엠(CRM197) 단백 접합 백신, 헤모필루스 인플루엔자 비형·파상풍톡소이드 접합 백신, 인터페론 알파-2a 주사액(유전자재조합), 주사용 건조 인터페론 알파-2a(유전자재조합), 주사용 건조 인터페론알파-2b(유전자재조합), 인터페론 알파-2b 주사액(유전자재조합), 주사용 건조 인터페론 감마(유전자재조합)를 각각 다음과 같이 개정한다.

헤모필루스 인플루엔자 비형·디프테리아 씨알엠(CRM197)단백 접합 백신

(Haemophilus influenzae type b-Diphtheria CRM197 Conjugated Vaccine)

1. 정 의

1.1 명 칭

이 제제는 □헤모필루스 인플루엔자 비형·디프테리아 씨알엠(CRM197) 단백 접합 백신□이라 한다.

1.2 제 제

이 제제는 헤모필루스 인플루엔자 비(b)형 올리고당류와 디프테리아 무독성변이체(CRM197)의 접합체를 함유하는 투명한 무색의 액상제제이다.

2. 일반 제조 기준

제제규칙 2. 생산관리항에 따른다.

3. 제조기준

3.1 재 료

3.1.1 균 주

3.1.1.1 헤모필루스 인플루엔자 비형 Eagan주 (PBCC197) 또는 이와 동등 이상의 면역원성을 가졌다고 인정되는 균주를 사용한다.

3.1.1.2 코리네박테리움 디프테리아 C7균주(□197) 또는 이와 동등 이상의 CRM197단백질 생산 능력을 가진 균주를 사용한다.

3.1.2 배 지

백신제조에 사용되는 배지는 제제가 충분한 항원성을 보유하는 경우에는 여하한 액체 배지라도 사용할 수 있으나, 인체에 고도의 과민성을 일으키는 물질을 포함하여서는 안된다.

3.2 원 액

3.2.1 헤모필루스다당류

3.2.1.1 배양액

배지에 NAD, Hemin등과 같은 적당한 영양소를 공급하면서 균주를 배양한 후 검경 및 적당한 배양법으로 검사하여 다른 균으로 오염되지 않은 것을 배양액으로 한다.

3.2.1.2 추출 및 정제

배양액을 여과한 후, 브롬화세틸트리메칠암모늄(cetyltrimetylammoniumbromide)으로 다당류를 침전시키고 0.4mol/L NaCl로 추출한 다음, 다시 95% 에탄올로 침전시키고 0.05mol/L NaCl로 추출하여 정제 헤모필루스다당류 원액을 얻는다.

3.2.2 헤모필루스올리고당류

정제 헤모필루스다당류 원액을 Sodium periodate(NaIO4)로 처리한 후 한외여과 등으로 올리고체를 분리함으로써 디프테리아 무독성변이체의 아미노기와 결합할 수 있는 알데히드기를 가진 활성 정제 헤모필루스올리고당류(HbO) 원액을 얻고, 이를 접합체 제조에 사용한다.

3.2.3 디프테리아 무독성변이체(CRM197)

3.2.3.1 유전자변이 및 배양액

무독성인 용균성 파아지 □197을 사용하여 디프테리아 독소 생산에 관여하는 유전자 부위를 변이를 일으킨 코리네박테리움 디프테리아 C7균주(□197)를 얻고, 이를 배양한 후 검경 또는 적당한 배양법으로 검사하여 다른 균으로 오염되지 않은 것을 배양액으로 한다.

3.2.3.2 추출 및 정제

배양액을 여과한 후 황산암모늄으로 침전시키고 추출한 다음, DEAE-세파로스 칼럼을 이용하여 정제한 것을 디프테리아 무독성 변이체(CRM197) 원액으로 하고, 이를 접합체 제조에 사용한다.

3.3 원액의 시험

3.3.1 헤모필루스다당류 원액

3.3.1.1 리보스 함량시험

검체 및 표준품을 희석할 때는 증류수 또는 생리식염액을 이용한다. 검체는 400□L당 리보스 함량이 약 30nmol이 되도록 희석하여 사용한다. 건조 디-리보스 표준품을 가지고 20, 30, 40nmol/400□L의 표준희석액을 만든다. 또 올시놀일수화물 0.15g을 95% 에탄올 1.5mL에 녹이고, 농염산 1L에 염화제이철 6수화물(FeCl3·6H2O) 0.5g을 녹인 용액 50mL와 섞어 올시놀 시약을 만든다. 검액 및 표준희석액을 각각 400□L씩 취하여 올시놀 시약을 800□L씩 넣고 진탕 혼합하여 100℃ 수욕에서 20분간 반응시킨 다음 빙수 중에서 10분 이상 냉각시키고 진탕하여 시험관벽의 응축물을 녹여낸다. 따로 증류수 또는 생리식염액을 가지고 똑같이 조작한 것을 공시험액으로 하고, 분광광도계를 이용하여 파장 670nm에서 흡광도를 측정한다. 표준액에서 얻은 측정치로 검량선을 작성한 다음 검액의 측정치를 비교하고 검액의 희석도를 곱하여 검체 중의 리보스 함량을 구한다. 이 때 함량은 33.0%이상이어야 한다.

3.3.1.2 단백질 함량시험

단백질 정량법(2)에 따르며, 함량은 0.8%미만이어야 한다.

3.3.1.3 핵산 함량시험

3.3.3.2항에 따라 검액 중의 DNA양(□)을 구하고, 3.3.1.1항에서 측정한 리보스 함량과의 중량 대 중량 백분율로서 DNA 함량을 나타낸다.

검액 중의 DNA 양(□)

DNA 함량 % =                           × 100

검액 중의 리보스 양(□)

이 때 함량은 0.8% 미만이어야 한다.

3.3.1.4 동정시험

5.5.1항에 따른다. 다만, 검체는 리보스 함량이 약 20□/mL이 되도록 희석하여 사용한다.

3.3.1.5 무균시험

무균시험법(1) 및 (2)에 따르며, 이에 적합하여야 한다.

3.3.1.6 발열성물질시험 또는 엔도톡신시험

다음 2개 항목 중 택일하여 시험할 수 있다.

3.3.1.6.1 발열성물질시험

발열성물질시험법에 따르며, 이에 적합하여야 한다. 다만 검체를 3mL 중 당류의 함량이 1□이 되도록 생리식염수로 희석한 후, 실험동물 kg 당 3mL를 주사한다.

3.3.1.6.2 엔도톡신시험

엔도톡신 시험법에 따라 시험할 때, 그 기준이 1.0EU/□ PRP이하이어야 한다. 다만, 재시험의 결과 역시 규격치를 유의하게 초과할 경우에는 발열성물질시험법을 적용한다.

3.3.2 헤모필루스올리고당류 원액(HbO)

3.3.2.1 무균시험

무균시험법(1) 및 (2)에 따르며, 이에 적합하여야 한다.

3.3.2.2 발열성물질시험 또는 엔도톡신시험

다음 2개 항목 중 택일하여 시험할 수 있다.

3.3.2.2.1 발열성물질시험

발열성물질시험법에 따르며, 이에 적합하여야 한다. 다만 검체를 3mL 중 당류의 함량이 1□이 되도록 생리식염수로 희석한 후, 실험동물 kg당 3mL를 주사한다.

3.3.2.2.2 엔도톡신시험

엔도톡신 시험법에 따라 시험할 때, 그 기준이 0.5EU/□ saccharide이하이어야 한다. 다만, 재시험의 결과 역시 규격치를 유의하게 초과할 경우에는 발열성물질시험법을 적용한다.

3.3.2.3 Dp 측정시험

Biogel P-100칼럼을 이용하여 검체를 분획하고, 각 분획을 둘씩 나누어 하나는 3.3.1.1항에 따라 리보스 함량을 측정하고 또 하나는 Park-Johnson assay에 따라 환원기를 정량한 다음, 두 측정치로부터 평균 Dp(Degree of polymerization)값을 구한다. 이 때 Dp는 15∼35이어야 한다.

3.3.3 디프테리아 무독성변이체(CRM197)원액

3.3.3.1 단백질 함량시험

3.3.1.2항에 따라 시험할 때, 함량은 검체 1mL당 3.0mg 이상이어야 한다.

3.3.3.2 핵산 함량시험

동일 균주로부터 생산된 DNA 표준액을 사용하여 형광광도법에 따라 검액 중의 DNA양(□)을 측정한 다음, 3.3.3.1항에서 CRM 단백질 함량과의 중량 대 중량 백분율로서 DNA함량을 나타낸다.

검액 중의 DNA양(□)

DNA 함량 % =                         × 100

검액 중의 CRM양(□)

이 때 함량은 1.0% 이하이어야 한다.

3.3.3.3 순도시험

분자량을 알고 있는 겔여과 단백질 혼합 표준품을 PBS로 녹여 HPLC주입용량 중의 단백질 양이 200□이 되도록 표준액을 만든다. 검체는 PBS로 희석하여 주입용량 중의 단백질 양이 50□이 되도록 검액을 만든다. 겔여과 고속액체크로마토그라프(HPLC)시스템을 켜고 pH 7.0 PBS를 1mL/min속도로 30분 이상 칼럼을 통과시켜 시스템을 보정한 후, 280nm에서 겔여과 표준액 및 검액의 흡광도를 측정한다. 표준액의 측정치를 각각의 분자량에 대해 plot하여 검량선을 만들고 검액의 측정치를 비교하여 검체의 분자량을 구한 다음, 분자량이 60,000인 것과 검량선상의 적분치를 비교할 때 그 백분율을 검체의 순도로 한다.

위와 같이 시험할 때 순도는 90%이상이어야 한다.

3.3.3.4 무균시험

무균시험법(1) 및 (2)에 따르며, 이에 적합하여야 한다.

3.3.3.5 동정시험

5.5.2항에 따른다. 다만, 검체는 단백질 함량이 약 400□/mL미만이 되도록 희석하여 사용한다.

3.3.3.6 발열성물질시험 또는 엔도톡신시험

다음 2개 항목 중 택일하여 시험할 수 있다.

3.3.3.6.1 발열성물질시험

발열성물질시험법에 따르며, 이에 적합하여야 한다. 다만 검체를 3mL 중 당류의 함량이 1□이 되도록 생리식염수로 희석한 후, 실험동물 kg 당 3mL를 주사한다.

3.3.3.6.2 엔도톡신시험

엔도톡신시험법에 따라 시험할 때, 그 기준이 1.0EU/□ protein 이하이어야 한다. 다만, 재시험의 결과 역시 규격치를 유의하게 초과할 경우에는 발열성물질시험법을 적용한다.

3.4 헤모필루스 올리고당류와 디프테리아 무독성변이체(CRM197)의 접합체

정제 헤모필루스 올리고당류(HbO)의 원액과 디프테리아 무독성변이체(CRM197)원액을 1 : 2의 비율로 섞고 Cyanoborohydride(NaCNBH3)를 첨가하여 결합시킨다. 반응하고 남은 올리고당의 알데히드기를 환원시키기 위해 Sodium borohydride(NaBH4)를 과량 가하고 잘 교반한 후 여과하여 과잉의 반응물과 cyanide를 제거한다. 이 정제 헤모필루스 올리고당-디프테리아 무독성변이체 결합물(HbOC)을 함유한 액을 접합체 원액으로 한다.

3.5 헤모필루스 올리고당류·디프테리아 무독성변이체(CRM197)접합체 원액의 시험

3.5.1 무균시험

무균시험법(1) 및 (2)에 따르며, 이에 적합하여야 한다.

3.5.2 당류와 단백질 함량비 측정시험

3.5.2.1항에 따라 측정한 리보스 함량과 3.5.2.2항에 따라 측정한 단백질 함량과의 비율(당류/단백질)은 0.30∼0.70이어야 한다.

3.5.2.1 리보스 함량시험

3.3.1.1항에 따라 측정할 때, 함량은 검체 1mL당 40□ PRP이상이어야 한다.

3.5.2.2 단백질 함량시험

3.3.1.2항에 따라 시험할 때, 함량은 검체 1mL당 100□이상이어야 한다.

3.5.3 유리당류 함량시험

C18 고형상추출법(C18 solid phase extraction assays)을 이용하여 접합체(HbOC)로부터 비결합 유리당류(HbO)를 분리정량한다.

□ 리보스 표준액(1nmol/□L) 100□L를 4.5% NaCl로 2000□L로 희석하여 표준희석액으로 한다.

□ 검체(HbOC)를 유리당류함량이 5□/mL이하, 단백질함량이 80□/mL 이하가 되도록 0.9% NaCl로 적당히 희석하여 검액으로 한다.

□ C18레진의 중량을 달고 메탄올을 첨가하여 1g당 20mL가 되도록 희석한 후 완전히 현탁시키고 1.0mL씩 취해 6개의 소량원심시험관에 나누어 넣는다. 원심분리기를 이용하여 최고속도로 5분간 원심분리한 후 상등액을 조심스럽게 취해서 버린다. 각 시험관에 물을 1.0mL씩 넣고 교반, 원심분리 후 상등액을 취해 버리는 조작을 2회 반복한다. 이 중 3개의 시험관에는 검액을, 다른 3개에는 0.9% NaCl(공시험액)을 1.0mL씩 넣어 15초간 최고속도로 진탕하고 중속도로 줄인 다음 15분 간격으로 15초간 최고속도로 올려주면서 총 60분간 진탕한다. 이것을 원심분리하고 상등액을 1mL 팁으로 가능한 0.95mL이상 취해 0.45□ 나일론 66 주사기 필터를 통과시켜 12×75mm 시험관에 모은다. 같은 팁으로 5% 메탄올 1mL를 취해 C18이 남아있는 소량원심시험관에 첨가하고 교반, 원심분리후 상등액을 취해(0.95∼1mL)위와 같은 방법으로 여과한 다음 다시 한번 메탄올 1mL로 추출, 원심분리, 상등액 여과하여 총 2.9∼3mL의 여액을 시험관에 모은다. 이것을 고속진공농축기를 이용하여 완전히 마를 때까지 농축시킨 다음 (18시간 정도) 다시 200□L의 물을 넣고 진탕혼합하여 녹여낸다. 표준희석액은 10, 100, 200□L를 각각 3개의 시험관에 넣고(0.5, 5.0, 10.0nmol에 해당) 4.5% NaCl로 200□L로 채운다. 따로 4.5% NaCl을 200□L씩 3개의 시험관에 넣어 공시험한다.

3.5.2.1항에 따라 리보스 함량을 측정하고, 각 측정치에서 공시험치를 빼주어 검체의 유리당류함량(□/mL)을 구한다. 이 때 유리당류 함량은 총당류의 20% 이하이어야 한다.

3.5.4 유리단백질 함량시험

겔여과 고속액체크로마토그라프법을 이용하여 접합체(HbOC)로부터 비결합 유리단백질을 분리정량한다.

□ 0.05mol/L Na2SO4, 0.02mol/L Na2PO4 완충액(pH 6.8)을 0.22□ 액체용 필터로 여과하여 이동상으로 한다.

□ CRM 단백질 표준품의 15% 수크로스 용액을 정제수로 희석한 표준원액(1.0mg/mL)을 100□L씩 분병하여 -70℃로 동결보관했다가 사용할 때에 이동상 900□L로 희석하여 표준액(100□/mL)으로 한다.

□ 3.5.2.2항에 따라 검체의 단백질함량을 측정할 때 함량이 500□/mL 이상인 검체는 이동상을 첨가하여 500□/mL이 되도록 희석하고, 함량이 500□/mL이하인 경우에는 10,000MW 멤브레인을 이용하여 750□/mL으로 농축시켰다가 다시 위와 같은 방법으로 500□/mL이 되도록 희석하여 이를 검액으로 한다.

□ 아래 표와 같이 각 표시량 만큼의 표준액(100□/mL)을 검액 1mL조제시에 사용된 검체량에 첨가하고 이동상을 가해 1mL으로 희석하여 혼합표준액으로 만든다.

농도(□CRM/mL)	%	검체속에 첨가한 표준액(100□/mL)의 □L수
0	0	0
5	1	50
10	2	100
15	3	150
25	5	250

□ 겔여과 HPLC칼럼에 1mL/min 속도로 이동상을 통과시키고 파장 210nm에서 검색한다.

검액 20□L(단백질 10□ 포함)와 혼합표준액 20□L씩을 통과시키고 20분 이상 검색하여 얻은 크로마토그람으로부터 각 CRM피이크의 면적을 구한다. 유리 CRM이 검액에서는 검출되지 않고 5□ CRM/mL혼합표준액에서는 검출될 경우 검체의 유리단백질 함량은 총단백질의 1%미만으로 본다. 또 검액에서 검출되면 표준액 면적에서 검액 면적을 뺀다. 표준액의 피이크 면적을 CRM %에 대해 plot하면 y절편이 검액 속의 유리 CRM함량(%)이 된다. 이 때 유리단백질 함량은 총단백질의 1%이하이어야 한다.

3.5.5 동정시험

3.5.5.1 헤모필루스올리고당 부위의 확인

5.5.1항에 따른다.

다만, 검체는 리보스 함량이 약 20□/mL이 되도록 희석하여 사용한다.

3.5.5.2 CRM단백질 부위의 확인

5.5.2항에 따른다.

다만, 검체는 단백질 함량이 400□/mL이하가 되도록 적당히 희석하여 사용한다.

3.5.6 잔류시액시험

검체속에 잔류하는 cyanide ion을 인산염액 및 클로라민 티 시약과 반응시켜 cyanogen chloride로 하고, 리피딘/바르비탈산 시약과 반응시켜 생성되는 적자색 색소를 분광광도계로 파장 578nm에서 비색정량한다.

이 때 잔류 cyanide함량은 1□당 500pg 미만이어야 한다.

3.5.7 분자량분포시험

검체는 필요하면 단백질이 약 250□/mL 함유되도록 생리식염액으로 희석한 다음 세파로스 CL-4B칼럼을 이용하여 입자크기별로 분획하고, 분획들 각각에 대해 3.5.2.1 및 3.5.2.2항에 따라 리보스 함량과 단백질 함량을 측정한 후 검량선을 작성하여 50% Kd단백질 값을 구한다. 이 때 50% Kd 값은 0.30∼0.60이어야 한다.

3.5.8 발열성물질시험 또는 엔도톡신시험

다음 2개 항목 중 택일하여 시험할 수 있다.

3.5.8.1 발열성물질시험

발열성물질시험법에 따르며, 이에 적합하여야 한다. 다만 검체를 3mL 중 당류의 함량이 1□이 되도록 생리식염수로 희석한 후, 실험동물 kg당 3mL를 주사한다.

3.5.8.2 엔도톡신시험

엔도톡신 시험법에 따라 시험할 때, 그 기준이 2.0EU/□ PRP이하이어야 한다.

다만, 재시험의 결과 역시 규격치를 유의하게 초과할 경우에는 발열성물질시험법을 적용한다.

3.5.9 이상독성부정시험

이상독성부정시험법(1) 및 (2)에 따르며, 이에 적합하여야 한다.

3.6 최종원액

접합체 원액을 1mL 중의 올리고당류 함량이 20□ PRP가 되도록 생리식염완충액으로 희석하여 이를 최종원액으로 한다.

3.7 최종원액의 시험

3.7.1 pH 측정시험

5.1항에 따른다.

3.7.2 무균시험

무균시험법(1) 및 (2)에 따르며, 이에 적합하여야 한다.

4. 분병과 용기

제제규칙 3. 분병과 용기 항에 따른다.

5. 검 정

5.1 pH측정시험

pH시험법에 따르며, pH는 5.4∼6.9이어야 한다.

5.2 총당류 함량시험

3.3.1.1항에 따라 측정할 때, 함량은 검체 0.5mL 중 8∼12□ PRP이어야 한다.

5.3 당류와 단백질 함량비 측정시험

3.5.2항에 따른다.

5.4 유리당류 함량시험

3.5.3항에 따라 시험할 때, 함량은 25%이하이어야 한다. 단, 국가검정 신청시는 20%이하이어야 한다.

5.5 동정시험

5.5.1 헤모필루스올리고당 부위의 확인

헤모필루스 협막다당류(PRP)에 특이성을 나타내는 항혈청을 이용하여 응집반응을 시험할 때, 육안으로 확인할 수 있는 응집반응이 나타나야 한다.

5.5.2 CRM 단백질 부위의 확인

토끼의 디프테리아톡소이드 항혈청을 디프테리아톡소이드로 코팅된 라텍스와 섞을 때 일어나는 응집반응이 CRM 단백질 존재시에 억제되는 원리를 이용하여 라텍스응집억제시험법(Latex agglutination inhibition test)에 따라 시험할 때 검액은 약간의 응집을 일으키지 않아야 하며, 음성대조액은 중등도의 응집 또는 강한 응집을 나타내어야 한다.

5.6 무균시험

무균시험법(1)에 따르며, 이에 적합하여야 한다.

5.7 발열성물질시험 또는 엔도톡신시험

다음 2개 항목 중 택일하여 시험할 수 있다.

5.7.1 발열성물질시험

발열성물질시험법에 따르며, 이에 적합하여야 한다. 다만 검체를 3mL 중 당류의 함량이 1□이 되도록 생리식염수로 희석한 후, 실험동물 kg당 3mL를 주사한다.

5.7.2 엔도톡신시험

엔도톡신 시험법에 따라 시험할 때, 검체 1mL당 50EU이하이어야 한다. 다만, 재시험의 결과 역시 규격치를 유의하게 초과할 경우에는 발열성물질시험법을 적용한다.

5.8 이상독성부정시험

이상독성부정시험법(1) 및 (2)에 따르며, 이에 적합하여야 한다. 다만, 검체량은 1 dose (0.5 mL)를 (1)의 경우 5.0 mL을 넘지 않는 양으로, (2)의 경우 1.0 mL를 넘지 않는 양으로 적당히 희석하여 주사한다.

6. 기 록

제제규칙 5. 기록항에 따른다.

7. 시공품

제제규칙 6. 시공품 항에 따른다.

8. 용기 및 포장의 표시

제제규칙 7. 용기 및 포장의 표시 항에 규정된 사항과 다음 사항을 기재하여야 한다.

8.1 사용법 및 용량

생후 2∼6개월 어린이에게는 2개월 간격으로 1회 0.5mL씩을 3회 대퇴부 외측면에 근육주사한다. 이전 투여경력이 없는 생후 7∼11개월 어린이에게는 2개월 간격으로 1회 0.5mL씩을 2회 대퇴부 외측면에 근육주사한다. 이전 투여경력이 없는 생후 12∼14개월 어린이에게는 1회 0.5mL를 대퇴부 외측면에 근육주사한다.

상기와 같이 기본접종을 받은 모든 어린이는 생후 15개월 이후에 1회의 추가접종을 받아야 하며 추가접종은 이전 투여일로부터 2개월 이상의 간격을 두고 이루어져야 한다.

이전 투여경력이 없는 생후 15개월∼5세 어린이에게는 1회 0.5mL를 대퇴부 외측면 또는 삼각근 부위에 근육주사한다.

9. 운 송

제제규칙 8. 운송 항에 따른다.

10. 저장과 유효기간

유효기간은 2년으로 한다.

헤모필루스 인플루엔자 비형·파상풍톡소이드 접합백신 개정

(Haemophilus influenzae type b-Tetanus Toxoid Conjugated Vaccine)

1. 정   의

1.1 명   칭

이 제제는 「헤모필루스 인플루엔자 비형·파상풍톡소이드 접합백신」이라 한다.

1.2 제   제

이 제제는 헤모필루스 인플루엔자 비(b)형 다당류와 파상풍톡소이드의 접합체를 함유하는 건조제제로서, 용제를 가하였을 때 무색 투명한 액상제제로 된다.

2. 일반제조기준

제제규칙 2. 생산관리항에 따른다.

3. 제조기준

3.1 재   료

3.1.1 균   주

3.1.1.1 헤모필루스 인플루엔자 비형 No. 1482주 또는 이와 동등 이상의 면역원성이 있다고 인정되는 균주를 사용한다.

3.1.1.2 파상풍균 Harvard주 또는 이와 동등 이상의 독소 생산 능력을 가진 균주를 사용한다.

3.1.2 배   지

백신 제조에 사용되는 배지는 제제가 충분한 항원성을 보유하는 경우에는 여하한 액체 배지라도 사용할 수 있으나, 인체에 고도의 과민성을 일으키는 물질을 포함하여서는 안된다.

3.2 원말 및 원액

3.2.1 헤모필루스다당류 원말

3.2.1.1 배양액

헤모필루스 균의 배양 완료 후 검경 및 적당한 방법으로 검사하며, 다른 균으로 오염되지 않은 배양액을 포르말린처리 등으로 불활화하여 원심분리하고 그 상층액을 사용한다.

3.2.1.2 추출 및 정제

세트리미드(Cetrimide) 침전, 에탄올 침전, 페놀 추출 그리고 한외여과 등을 통해 다당류 추출 및 정제하여 진공 건조시키고, 이를 헤모필루스다당류 원말로 한다. 헤모필루스다당류 원말에 대해서는 3.3.1항의 시험을 실시하여야 하며, 시험을 마친 원말은 증류수 등으로 용해하여 ADH 등으로 환원처리한 다음 3.3.2항의 시험을 거친 후 정제하거나 정제 후 진공건조시킨다. 이 환원된 다당류를 접합체 제조에 사용한다.

3.2.2 파상풍 톡소이드 원액

파상풍 톡소이드 3.2항에 따른다.

3.3 원말 및 원액의 시험

3.3.1  헤모필루스다당류 원말

3.3.1.1 리보스함량시험

올시놀법 등 적당한 방법으로 측정할 때, 그 함량은 32w/w% 이상이어야 한다.

3.3.1.2 인함량시험

첸법 등 적당한 방법으로 측정할 때, 그 함량은 6.8-9.0w/w%이어야 한다.

3.3.1.3 분자량 측정시험

다음 2개 항목 중 택일하여 시험할 수 있다.

3.3.1.3.1 겔크로마토그래프법 - 인함량 측정

세파로스 CL-4B 칼럼을 사용하여 측정한다. 용출액은 0.01% 질화나트륨(NaN3)을 함유하는 0.2M 암모늄아세테이트 완충액을 사용하며, pH 7.0으로 맞추고, 다당류 3mg을 함유하는 검체 1ml를 칼럼에 적용시켰을 때, Kd값 0.3 이전에 용출되는 인함량이 전체 용출량의 50% 이상이어야 한다.

3.3.1.3.2 HPSEC법 - 올시놀법

TSK PWXL 칼럼을 사용하여 HPSEC(High Performance Size Exclusion Chromatography)방법으로 측정한다. 이동상은 0.2M 염화나트륨을 함유하는 0.01M Tris용액을 사용하며 pH 7.0으로 맞추고, 유속은 분당 0.3 ml로 한다. 검체를 이동상으로 4mg/ml의 농도가 되게 희석하고 이 액 100□를 칼럼에 주입하여 용출액 중의 다당류를 waters R410 흡광분석기로 측정하였을 때, Kd값은 0.4 이하이어야 하며, Kd값 0.3 이전에 용출되는 다당류의 함량은 전체 용출량의 50% 이상이어야 한다.

3.3.1.4 동정시험

다음 2개 항목 중 택일하여 시험할 수 있다.

3.3.1.4.1 중화반응

5.6.1항에 따라 시험하며, 이에 적합하여야 한다.

3.3.1.4.2 ELISA법

탄산 완충액으로 희석한 토끼의 항-다당류 항체 100□를 코팅한 플레이트의 각 well에 적당한 비율로 희석한 검체, 표준품 희석액 및 공시액(인산완충액)을 100□씩 가한다. 하룻밤 냉장보관 후 인산완충액으로 희석한 토끼의 항-다당류 IgG /Peroxidase conjugate를 100□씩 가하여 30분간 실온에서 교반한다. 효소 기질(OPD/H2O2)을 100□씩 가하여 실온, 암소에서 30분간 배양한 다음, 1N H2S04 50□를 가해 효소반응을 중지시킨다. 490nm에서 흡광도를 측정하였을 때, 검체 중 다당류의 흡광도는 다음과 같아야 한다.

검체 중 다당류의 흡광도 〉 x + t 0.01□

(t 0.01 : 단측검정시의 유의수준을 0.01로 하였을 때의 t-student 값

x : 공시액 흡광도의 평균값

□ : 표준편차)

3.3.1.5 단백질함량시험

단백질정량법(2)에 따르며 함량은 1w/w% 이하이어야 한다.

3.3.1.6 핵산함량시험

대한약전 일반시험법 중의 [흡광도측정법]에 따르며, 원말 0.1w/v% 수용액에 대해 [eqn: { E}`_{1□} ^{1% }](260□): 200을 이용하여 측정할 때의 핵산 함량이 1w/w% 이하이어야 한다.

3.3.1.7 발열성물질 또는 엔도톡신시험

3.3.1.7.1 발열성물질시험

검체를 생리식염수로 1ml 중 다당류의 함량이 1□이 되도록 희석한 다음, 발열성물질시험법에 따라 시험할 때 이에 적합하여야 한다. 단, 검체는 시험동물 1 Kg당 1ml로 한다.

3.3.1.7.2 엔도톡신 시험

엔도톡신시험법에 따라 시험할 때 검체 1□당 엔도톡신으로서 10 IU 이하이어야 한다.

3.3.2  환원처리 헤모필루스 다당류

3.3.2.1 분자량 측정시험

다음 2개 항목 중 택일하여 시험할 수 있다.

3.3.2.1.1 겔크로마토그래프법 - 인함량 측정

3.3.1.3.1항에 따라 실험한다. 단, 용출액은 0.1M의 염화나트륨 용액을 사용하며, 다당류 5-8mg을 함유하는 검체 1ml를 칼럼에 적용시켜 수집된 분획으로부터 다당류의 Kd값을 구하고, Kd값이 0-0.2, 0.2-0.9, 0.9-1.15를 기준으로 분획된 분획물로부터 3.3.1.2항에 따라 인함량을 측정한다. 이때, 다당류 Kd값은 0.4-0.6이어야 하며, Kd값이 0.2 이하에서 용출된 분획물의 인함량은 전체 인함량의 15% 이하이어야 한다.

3.3.2.1.2 HPSEC법 - 올시놀법

3.3.1.3.2항에 따라 실험한다. 단, 검체를 이동상으로 2배 희석하여 이 액 100□를 칼럼에 주입시키며, 용출액 중의 다당류는 waters 486 Tunable 흡광분석기(206□)로 측정한다. 이 때, Kd값은 0.4 이하이어야 하며, Kd값 0.3 이전에 용출되는 다당류의 함량은 전체 용출량의 25% 이상이어야 한다.

3.3.2.2 ADH 함량시험

검체를 0.05M 염화나트륨용액에 녹여 1ml당 5mg이 되도록 희석하여 검액으로 한다. ADH(Adipic acid dihydrazide) 표준품 87.1mg을 100ml의 증류수에 녹인 후 100배 희석하여 표준희석액(1)을 만들고, 다시 10배 더 희석하여 표준희석액(2)로 한다. 테트라보레이트나트륨·10수화물(Sodium Tetraborate·10H2O) 5g을 증류수 100ml에 녹여 반응액을 만든다. 또한, TNBS 3g을 정제수 100ml에 녹여 TNBS용액을 만든다.

검액 1ml와 표준희석액(1) 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0ml를 각각 취하여 전체분량이 1ml가 되도록 증류수로 채운 후, 반응액 1ml와 TNBS용액 0.3ml를 섞어 실온에서 30분간 반응시킨 다음 분광광도계를 사용하여 500nm에서 흡광도를 측정한다. 표준희석액에서 얻은 측정치로 검량선을 작성한 다음 검액의 측정치를 비교하고 검액의 희석도를 곱하여 검액중의 전체 ADH함량(A)를 계산한다. 3.3.2.1항 시험시 Kd값 0.9 이상에서 용출되어진 분획물 2ml와 표준희석액(2) 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5ml를 각각 취하여 전체분량이 2ml가 되도록 증류수를 채운 후, 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, TNBS용액 0.3ml를 섞어 30분 후 500nm에서 흡광도를 측정한다. 표준희석액에서 얻은 측정치로 검량선을 작성한 다음 검액의 측정치를 비교하고 검액의 희석도를 곱하여 검액중의 유리 ADH함량(B)를 계산한다:

ADH 함량비 = (A-B)×174.2×10-4×100 (%)

유리 ADH비 = B÷A

이때, 얻어진 ADH함량비는 1.4-2.6w/w%이어야 하며, 유리 ADH비율은 0.1 이하이어야 한다.

3.3.2.3 잔류 Cyanide 함량시험

잔류하는 Cyanide 이온을 가열, 증발시켜 1N 수산화나트륨용액에 용해시킨 후, 인산 및 포화브롬액과 반응시켜 Cyanogen bromide를 생성한 후, 가스크로마토그래프로 분석한다. 이때 잔류 Cyanide 함량은 5 ppm 이하이어야 한다.

3.3.3  파상풍톡소이드 원액

3.3.3.1 단백질소와 전질소함량비 측정시험

검체에 1ml 36N 황산을 섞어 4시간 반응시키고 증류수로 2-3회 씻어 침출시킨다. 침전물에 5ml의 증류수를 넣고 가열, 증발시키고 남은 잔류물에 다시 300g/□의 수산화나트륨용액 10ml를 넣고 가열한 후, 남은 잔류물을 0.01N 염산용액 5.0ml에 녹이고 적정액(0.01N 수산화나트륨용액)으로 적정(Titration)한다. 적정액 1ml는 0.14 mg의 질소함량을 나타내며, 대조군을 사용하여 적정값을 보정한다.

전질소함량(mg/ml)= [eqn: { (대조군-~적정값~-~검체적정값) ~×~0.14} over {0.01~×~검체량 }]

단백질정량법(1)에 따라 단백질소를 시험하고, 앞의 두 값으로부터 단백질소와 전질소량의 비율을 계산할 때 그 비율이 80% 이상이어야 한다.

3.3.3.2 흡광도측정시험

대한약전 일반시험법중의 [흡광도측정법]에 따라 280nm 및 260nm에서의 흡광도를 측정하여, 그 비율을 계산할 때 1.3 이상이어야 한다.

3.3.3.3 인함량시험

3.3.1.2항에 따라 시험한다. 이때, 인함량이 단백질 1mg당 1.5□ 미만이어야 한다.

3.3.3.4 잔류 포름알데히드 함량시험

포름알데히드정량법에 따르며 이때 잔류포름알데히드 함량은 단백질 1mg당 10□ 미만이어야 한다.

3.3.3.5 순도시험

표준 파상풍항독소(Flocculation 용)를 사용하여 항체변량법에 의한 시험관내 침강반응법으로 측정할 때, 단백질소 1ml당 1500Lf치 이상을 함유하여야 한다.

3.3.3.6 분자량 측정시험

고속액체크로마토그래프(HPLC)법에 따라 시험한다. TSK 3000 SW칼럼을 사용하고, 용출액은 0.05%의 질화나트륨(NaN3)이 함유된 0.1M의 인산완충용액(pH 7.0)으로 하며, 유속은 분당 0.5ml로 한다. 인산완충용액에 녹인 1mg/ml 농도의 검체를 0.22□ 필터에 거른 후, 15-20□ 용량을 주입시켰을 때, 50% 이상이 단분자 형태(Monomeric form)의 파상풍톡소이드이어야 한다.

3.3.3.7 무균 시험

무균시험(1) 및 (2)에 따르며, 이에 적합하여야 한다.

3.3.3.8 발열성물질시험

검체를 생리식염수로 1ml 중 단백질의 함량이 2□이 되도록 희석한 다음, 발열성물질시험법에 따라 시험할 때 이에 적합하여야 한다. 단, 검체는 시험동물 1 Kg당 1ml로 한다.

3.3.3.9 무독화 시험

파상풍톡소이드 5.7항에 따른다.

3.4 헤모필루스다당류와 파상풍톡소이드의 접합체

적당한 결합체를 사용하여 환원된 헤모필루스다당류와 파상풍톡소이드를 결합시켜 헤모필루스다당류-파상풍톡소이드 접합체를 제조한다. 제조된 접합체를 백당 농도 구배 초원심분리등을 하여 고분자접합체를 수거하고 이를 헤모필루스다당류와 파상풍톡소이드의 접합체 원액으로 한다.

3.5 헤모필루스다당류와 파상풍톡소이드의 접합체 원액의 시험

3.5.1 무균시험

무균시험법 (1) 및 (2)에 따르며, 이에 적합하여야 한다.

3.5.2 단백질과 다당류 함량비 측정시험

단백질 정량법(2)에 따라 단백질 함량을 측정한다.

다당류 함량은 올시놀법이나 또는 첸법 등 적당한 방법으로 인함량을 측정하여 3.3.1.2항에서 구한 다당류 원말의 인함량 비율로부터 구한다.

다당류 함량(mg/□) = [eqn: rm {인함량(mg/□)~×~100 } over {다당류원말~인함량(%) }]

앞의 두 값으로부터 다당류 함량에 대한 단백질함량 비율을 구할 때, 그 비율은 1.8-3.0이어야 한다.

3.5.3 분자량측정시험

3.5.3.1 겔크로마토그래프법 - 인함량 측정

3.3.1.3.1항 시험법에 따라 시험할 때 Kd값 0.2 이전에 용출되는 인함량이 60% 이상이어야 한다.

3.5.3.2 HPSEC법 - 올시놀법

3.3.2.1.2항 시험법에 따라 시험할 때, Kd 0.2이전에 용출되는 다당류-파상풍톡소이드 접합체의 함량은 70% 이상이어야 한다.

3.5.4 접합물 측정시험

다음 2개 항목 중 택일하여 시험할 수 있다.

3.5.4.1 고분자접합체 함량시험

검체를 8.5% 백당을 포함하는 10mM의 Tris-HCl(pH 7.0) 완충액으로 녹인 다음 5.5.1항에 따라 시험할 때, 이에 적합하여야 한다.

3.5.4.2 유리다당류 함량 시험

5.5.2항법에 따라 시험할 때, 이에 적합하여야 한다.

3.5.5 동정시험

5.6.1과 5.6.2항 또는 5.6.3항에 따라 시험할 때, 이에 적합하여야 한다.

3.5.6 잔류 EDAC 함량시험

다음 2개 항목 중 택일하여 시험할 수 있다.

3.5.6.1 분광광도법

헤모필루스다당류와 파상풍톡소이드의 접합체 제조시 EDAC(Ethyl dimethyl aminopropyl carbodimide)를 사용하였을 경우, 분광광도계를 사용하여 599nm에서 흡광도를 측정하였을 때 잔류함량은 검체 1□당 10□M 이하이어야 한다.

3.5.6.2 HPLC법

C18 칼럼을 이용하여 RP-HPLC(reversed-phase high performance liquid chromatography)방법으로 측정한다. 이동상은 2% 아세토니트릴을 함유하는 20 mM 인산완충액(pH 3.25)으로 하며, 유속은 1ml/분으로 한다. 0.125-0.500□를 함유하도록 희석한 EDAC 표준품을 칼럼에 주입하여 수집한 분획을 가지고 214 nm에서 흡광도를 측정하여 표준액이 나타내는 피크면적으로부터 검량선을 작성한다. 동일한 방법으로 검체 100 □를 칼럼에 주입하여 함량을 산출할 때, EDAC 함량은 1.5 □/ml 이하이어야 한다.

3.5.7 페놀함량 시험

페놀을 함유하고 있는 제제에 한한다.

페놀정량법에 따라 시험할 때, 함량은 검체 1□당 1mg 이하이어야 한다.

3.5.8 파상풍톡소이드 무독화시험

3.3.3.9항에 따른다. 다만, 검체가 분말일 경우, 다당류 농도가 1ml당 20□이 되도록 8.5% 백당을 함유하는 10mM의 Tris-HCl(pH 7.0) 완충액으로 희석하여 사용한다.

3.5.9 A·B혈액형물질 부정시험

3.5.9.1 재 료

검체는 증류수 1ml에 다당류 1.4□이 함유되도록 조제한 것을 사용한다. 항A 및 항 B혈청, A형 및 B형 적혈구 그리고 0.05% 특이적 A·B혈액형물질(50□/0.1ml)을 사용한다. 항혈청은 생리식염수로 2배 단계희석액을 만들고, A형 및 B형의 적혈구는 생리식염수로 희석하여 각각 1v/v% 부유액으로 만들어 각 항혈청 희석액 0.1ml를 동량으로 첨가하고 진탕교반하여 30분간 실온에 방치한 후 1,000 rpm으로 원심분리한다. 적혈구 응집이 인정되는 혈청 최대희석배수를 응집 1단위로 하고 그 2배 농도(2단위)의 항혈청 희석액을 본 시험에 사용한다. 감도측정용으로 특이적 A·B혈액형 물질을 각각 1 : 8 - 1 : 4,096까지 2배 단계 희석한 것을 사용한다.

3.5.9.2 시 험

검체 0.1ml, 생리식염수 0.1ml(항혈청대조용), 생리식염수 0.2ml(적혈구대조용) 및 2배 단계 희석 특이적 혈액물질을 각각 2개를 시험관에 A형용과 B형용으로 나누고, 2단위 각 항혈청 희석액 0.1ml를 각각의 적혈구대조용 시험관을 제외한 전체 시험관에 넣고 진탕교반하여 실온에 10분간 방치후 각 시험관에 동종 적혈구 1% 부유액 0.1ml씩을 넣는다. 이를 진탕교반하여 실온에 30분간 방치하고 1,000rpm으로 1분간 원심분리한 후 응집유무를 육안으로 관찰한다. 본 시험의 감도를 결정하기 위해 특이적 혈액물질 2배 단계 희석액이 응집저지를 나타내는 최대 희석배수에서 특이적 혈액형 물질농도(5□/0.1ml)를 나눈다.

3.5.9.3 판  정

시험은 다음 조건을 만족할 때 적합으로 한다.

1. A형 검출계의 감도가 0.4□/0.1ml 이하일 때;

2. B형 검출계의 감도가 0.4□/0.1ml 이하일 때;

3. 항혈청 대조응집이 인정될 때;

4. 적혈구 대조응집이 인정되지 않을 때 그리고

5. 검체응집이 인정될 때.

3.6 최종원액 및 건조

접합체 원액을 적당한 완충액 및 주사용 증류수로 희석한 다음, 안정제로 백당 또는 유당을 가하여 최종원액으로 한다. 최종원액에 대해서는 3.7항의 시험을 실시하여야 하며, 시험을 마친 최종원액은 분주하여 동결건조시킨다.

3.7 최종원액의 시험

3.7.1 pH 측정시험

pH 측정법에 따르며, 제조국의 기준에 따른다.

3.7.2 무균시험

무균시험법 (1) 및 (2)에 따르며, 이에 적합하여야 한다.

4. 분병과 용기

제제규칙 3. 분병과 용기항에 따른다.

5. 검 정

5.1 pH 측정시험

pH 측정법에 따르며, 제조국의 기준에 따른다.

5.2 함습도시험

함습도 측정법에 따르며, 3% 이하이어야 한다.

5.3 다당류 함량시험

올시놀법 또는 첸법 등으로 인함량을 측정하여 다당류 함량을 산출할 때, 그 함량은 8-12□/0.5ml이어야 한다.

다당류 함량(□/□) = 리보오스 함량(□/□) × 2.488 (올시놀법)

다당류 함량(mg/□) = [eqn: rm {인함량(mg/□)~×~100 } over {다당류원말~인함량(%) }] (첸법)

5.4 단백질과 다당류 함량비 측정시험

단백질정량법(2)에 따라 단백질 함량을 측정하고, 5.3항에서 다당류 함량을 구한 다음, 앞의 두 값으로부터 다당류 함량에 대한 단백질함량 비율을 구할 때, 그 비율은 2.0-4.0이어야 한다.

5.5 접합물 측정 시험

다음 2개 항목 중 택일하여 시험할 수 있다.

5.5.1 고분자접합체 함량시험

바이알당 0.5ml의 증류수를 가하여 3ml의 검액(샘플 A)을 제조하여 5M의 염화나트륨용액 0.75ml와 무수에탄올 15ml를 가하여 잘 섞은 후 -20℃에서 64시간 이상 방치하여 침전시키고, 5±3℃에서 4500g로 90분간 원심분리하여 그 상층액을 샘플B로 한다. 침전물을 50% 에탄올 용액으로 다시 녹여 실온에서 60분간 흔들어 추출한 후, 15℃에서 4500g로 60분간 원심분리하여 그 상층액을 샘플C로 하고, 침전물에는 1N 수산화나트륨용액 0.5ml를 더하여 잘 섞은 후 다시 1.25ml의 증류수를 넣어 샘플D로 한다. 얻어진 모든 샘플들 (A,B,C,D)은 각각 첸법에 의해 인함량을 정량하고, 표준희석액에서 얻은 측정치로 검량선을 작성한 다음 샘플의 측정치를 비교하고 샘플의 희석도를 곱하여 샘플중의 실제 인함량을 계산할 때, 고분자 접합체 분획(샘플D)의 인함량이 분획된 샘플 B,C,D의 인함량 합에 비교하여 75% 이상이어야 한다.

5.5.2 유리다당류 함량 시험 (ELISA법)

검체와 표준품을 식염수에 녹여 1ml당 다당류의 함량이 1.088□이 되도록 희석한다. 준비한 기니픽의 파상풍 항혈청 희석액 0.5ml를 검체 및 표준품의 희석액 0.5ml에 가하여 37℃, 2시간 동안 교반한다. 계속 실온에서 교반하면서, 이 혼합액에 폴리에틸렌글리콜6000 360□를 한방울씩 떨어뜨린다. 폴리에틸렌글리콜을 다 가한 후엔 교반을 멈추고 실온에서 30분 동안 방치한 다음, 25℃에서, 12000g로 30분간 원심분리한다.  원심분리 후 상등액은 냉장온도로 냉각시킨다. 3.3.1.4.2항과 같은 방법으로 이 액 중의 다당류 함량을 측정하고, 5.6.3항에 따라 시험하여 다당류-파상풍 톡소이드 접합체가 존재하지 않음을 확인한다.

백신에 함유된 유리 다당류의 비율을 다음과 같이 계산할 때, 20% 이하이어야 한다.

상등액에 포함된 다당류의 함량 (ELISA법)

유리다당류의 비율(%)=100× □□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□

백신 중 총 다당류의 함량 (올시놀법)

5.6 동정시험

5.6.1과 5.6.2를 하거나, 5.6.3을 하였을 때 적합하여야 한다.

5.6.1 헤모필루스 다당류

다당류에 특이성을 나타내는 항혈청을 이용하여 겔확산법 등으로 시험할 때 뚜렷한 침강선을 나타내어야 한다.

5.6.2 파상풍톡소이드

파상풍톡소이드 5.6항에 따르며, 이에 적합하여야 한다.

5.6.3 헤모필루스 다당류-파상풍 톡소이드 접합체 (ELISA법)

탄산완충액으로 희석한 기니픽 파상풍 항독소 100□를 코팅한 플레이트의 각 well에 적당한 비율로 희석한 검체, 표준품 희석액 및 공시액(인산완충액)을 100□씩 가한다

하룻밤 냉장보관한 다음 인산완충액으로 희석한 토끼의 항-다당류 IgG / Peroxidase conjugate를 100□씩 가하여 30분간 실온에서 교반한다. 효소 기질(OPD/H2O2)을 100□씩 가하여, 실온, 암소에서 30분간 배양한 다음 1N H2S04 50□를 가해 효소반응을 중지시킨다. 490nm에서 흡광도를 측정하였을 때, 검체 중 접합체의 흡광도는 다음과 같아야 한다.

접합체의 흡광도 〉 x + t 0.01□

(t 0.01 : 단측검정시의 유의수준을 0.01로 하였을 때의 t-student 값

x : 공시액 흡광도의 평균

□ : 표준편차)

5.7. 무균시험

무균시험법(1)에 따르며, 이에 적합하여야 한다.

5.8 발열성물질시험 또는 엔도톡신 시험법

다음 2개 항목 중 택일하여 시험할 수 있다.

5.8.1 발열성 물질시험

동결건조 검체를 첨부용제로 용해하여 생리식염수로 1ml 중 다당류의 함량이 0.1□이 되도록 희석한 다음, 발열성물질시험법에 따라 시험할 때 이에 적합하여야 한다. 단, 검체량은 시험동물 1 Kg당 1ml로 한다.

5.8.2 엔도톡신 시험

엔도톡신시험법에 따라 시험할 때 검체 0.5ml당 엔도톡신으로서 30 IU 이하이어야 한다.

5.9 이상독성부정시험

이상독성부정시험법(1) 및 (2)에 따르며, 이에 적합하여야 한다.

6. 기    록

제제규칙 5. 기록항에 따른다.

7. 시 공 품

제제규칙 6. 시공품항에 따른다.

8. 용기 및 포장의 표시

제제규칙 7. 용기 및 포장의 표시항에 규정된 사항과 다음의 사항을 표시하여야 한다.

8.1 사용된 균주명

8.2 0.5ml 중의 폴리사카라이드 함량

8.3 □사용전 충분히 흔들것□이란 문자

8.4 사용법 및 사용량

(1) 6개월 이하의 영아에 대해서는 0.5ml를 1∼2개월 간격으로 3회 피하 또는 근육주사한다.

(2) 6개월에서 12개월 미만의 영아에 대해서는 0.5ml를 1∼2개월 간격으로 2회 피하 또는 근육주사한다.

(3) 1세 이상의 유아에 대해서는 0.5ml를 1회 접종한다.

9. 운   송

제제규칙 8. 운송항에 따른다.

10. 저장과 유효기간

유효기간은 3년으로 한다.

인터페론 알파-2a 주사액(유전자 재조합)

Interferon Alfa-2a Injection(rDNA)

1. 정    의

1.1 명    칭

이 제제는 「인터페론 알파-2a 주사액(유전자 재조합)」이라 한다.

1.2 제    제

이 제제는 유전자 재조합으로 얻은 인터페론 알파-2a를 함유한 무색 또는 엷은 황색의 액상제제이다.

2. 일반제조 기준

제제규칙 2. 생산관리항에 따른다.

3. 제조기준

3.1 재료

3.1.1 제조용 균주

제조용 균주는 사람의 백혈구로부터 분리된 인터페론 알파-2a 생성유전자를 플라스미드 등 벡터를 이용하여 대장균의 형질을 전환시킨 후 인터페론 생성기능을 가진 균주로 한다. 배양액에는 적당한 항생물질을 가한다.

3.2 추출 및 정제

3.2.1 추출

인터페론 알파-2a을 발현시킨 대장균으로부터 산성화·분쇄 혹은 원심분리방법 등으로 인터페론 알파-2a 추출물을 얻는다.

3.2.2 정제

면역크로마토그래프법 등 적당한 방법을 이용한다.

3.3 원액

정제된 인터페론 알파-2a액을 원액이라 한다.

원액에는 3.4항의 시험 후 적당한 부형제를 넣을 수 있다.

3.4 원액의 시험

3.4.1 비활성시험

3.6.2.항 역가시험에 따라 역가를 측정하고 단백질정량법(2)에 따라 총 단백질량을 측정하고 역가와 단백질량의 비를 산출하였을 때 단백질 1 mg중 인터페론 알파-2a는 2.0 ∼ 3.2 × 108 국제단위를 함유하여야 한다.

3.4.2 항생제부정시험

적당한 방법으로 시험할 때 염산 테트라싸이클린이 들어있는 경우 함량은 0.25  □/mL 이하이어야 한다.

3.4.3 순도시험

3.4.3.1 전기영동법

5.5.2방법으로 측정하였을 때 총 단백질 함량 중 98 % 이상이 인터페론 알파-2a이어야 하고, 또한, 분자량 19000 달톤 이상의 다중체가 1 % 이하이고, 15000 달톤 이하의 분절체가 1 % 이하이어야 한다.

3.4.3.2 숙주유래 DNA시험

Hybridization 등의 적당한 방법으로 시험할 때 총 DNA 함량이 80 pg/mg 이하이어야 한다.

3.4.3.3 숙주유래 단백질 시험

적당한 방법으로 시험할 때 E.coli 단백질이 30 ng/mg 을 초과해서는 안된다.

3.4.3.4 Mouse IgG시험

적당한 방법으로 시험할 때 검출한계에서의 양보다 3 ppm을 초과해서는 안된다.

3.4.3.5 유사단백질시험

역상 HPLC법 등의 적당한 방법으로 시험할 때 본래 구조의 인터페론 이외에 유사 구조의 인터페론도 3.0 % 이하이고 전체 합이 5.0 % 이하이어야 한다.

3.4.4 아미노산조성시험

아미노산 잔기수를 적당한 방법으로 측정할 때 다음 범위에 적합하여야한다.

Amino Acid	Theoretical Number of Residues	Accepted Range
Aspartic acid and asparagine Threonine Serine Glutamic acid and Glutamine Proline Glycine Alanine Valine Methionine Isoleucine Leucine Tyrosine Phenylalanine Histidine Lysine Arginine Cysteine as cysteic acid Tryptophan	12 10 14 26 5 5 8 7 5 8 21 5 10 3 11 9 4 2	11.3 - 12.7 9.2 - 10.5 12.3 - 14.5 25.1 - 26.8 3.5 - 6.4 5.0(ref.) 7.3 - 8.6 5.9 - 7.8 3.9 - 5.5 7.0 - 8.5 20.0 - 22.0 4.6 - 5.3 9.6 - 10.5 2.4 - 3.5 10.5 - 11.7 8.4 - 9.4 2.9 - 4.5 1.3 - 2.9

3.4.5 무균시험

무균시험법 (1) 및 (2)에 따르며, 이에 적합하여야 한다.

3.4.6 발열성물질시험 또는 엔도톡신시험

5.4에 따라 시험할 때 이에 적합하여야 한다.

3.5 최종원액

원액에 적당한 부형제를 넣어 최종원액으로 한다.

3.6 최종원액의 시험

3.6.1 pH측정시험

pH측정법에 따라 시험할 때 4.8 ∼ 5.2이어야 한다.

3.6.2 역가시험

항 바이러스 활성을 측정할 때 상용표준 인터페론 알파-2a 역가보다 동등 또는 그 이상이어야 한다.

4. 분병과 용기

제제규칙 3. 분병과 용기항에 따른다.

5. 검    정

5.1 pH측정시험

이 제제의 pH는 4.7 ∼ 5.3이어야 한다.

5.2 무균시험

무균시험법 (1)에 따르며 이에 적합하여야 한다.

5.3 이상독성부정시험

이상독성부정시험법 1 또는 2에 따르며, 이에 적합하여야 한다. 다만, 2법을 실시할 경우 다음의 방법을 사용할 수 있다.

17∼22 g의 건강한 마우스 5마리에 검체 0.5 mL 씩을 정맥주사하고 24시간 관찰한다. 관찰기간 중 어떤 마우스도 사망하지 않으면 적합하며 2마리 이상 사망하면 부적합한 것으로 한다. 단, 5마리 중 1마리가 사망하면 반복 시험하여 어떤 마우스도 사망하지 않을 경우 적합한 것으로 한다.

5.4 발열성물질시험 또는 엔도톡신시험

일반시험법 중 발열성물질시험 또는 엔도톡신시험법에 따르며 이에 적합하여야 한다. 이때 발열성물질시험법의 경우, 검체의 양은 동물 체중 kg당 150만 국제단위로 하고, 엔도톡신시험법의 경우 그 기준은 60만 국제단위당 0.25 E.U. 미만이어야 한다. 다만, 재시험 결과 역시 규격치를 유의하게 초과할 경우에는 발열성물질시험법을 적용한다.

5.5 동정시험 : (1), (2) 또는 (3)에 따라 시험한다.

5.5.1 조직배양법

조직 배양에서 수포성 구내염 바이러스(VSV) 또는 뇌신근염바이러스(EMCV)활성의 억제가 확인되거나 또는 항 인터페론 알파-2a 혈청에 의해 항 바이러스 활성이 중화되어야 한다.

5.5.2. 전기영동법

에스 디 에스-폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동으로 분자량을 확인한 후 염색 된 건조겔을 가지고 계산하였을 때 95 % 이상이 인터페론 알파-2a 단백질이어야 한다.

5.5.3. 역상 HPLC법

역상 HPLC법으로 측정하여 산화형 인터페론이 5 % 이하이고, N-아세틸화 인터페론이 5 % 이하이며, 기타의 다른 피이크가 총 5 % 이하 이어야 한다.

5.6 역가시험

검체 및 표준품을 MDBK 등의 감수성있는 세포와 동량으로 배양한 후 세포단층이 형성되면 수포성 구내염 바이러스(VSV)등의 공격바이러스를 가한다. 현미경으로 세포병변효과(CPE)의 진행이 확인되면 염색, 세척후 실온에서 건조한 다음 2-methoxyethanol 등으로 추출한 후 550 nm에서 각 웰에 대한 흡광도를 재서 항 바이러스 활성을 측정한다. 표준품과 비교하여 환산하였을 때 검체역가는 표시역가의 70 ∼ 150 %이어야 한다.

6. 기    록

제제규칙 5. 기록항에 따른다.

7. 시 공 품

제제규칙 6. 시공품항에 따른다.

8. 용기 및 포장의 표시

용기 및 포장의 표시항에 따른다.

9. 운    송

제제규칙 8. 운송항에 따른다.

10. 유효기간

유효기간은 24 개월로 한다.

주사용 건조 인터페론 알파-2a (유전자재조합)

Freeze-Dried Interferon Alfa-2a for Injection(rDNA)

1. 정 의

1.1 명칭

이 제제는 「주사용 건조 인터페론 알파-2a(유전자재조합)」라 한다.

1.2 제제

이 제제는 유전자 재조합으로 얻은 인터페론 알파-2a를 함유한 건조제제이다. 용제를 넣었을 때 무색, 백색 또는 엷은 황색의 액상제제이다.

2. 일반제조 기준

제제규칙2. 생산관리항에 따른다.

3. 제조기준

3.1 재료

3.1.1 제조용균주

제조용 균주는 사람의 백혈구로부터 분리된 인터페론 알파-2a 생성유전자 또는 유전자 합성기로 합성한 인터페론 알파-2a 생성유전자를 플라스미드 등 벡터를 이용하여 대장균, 효모주 등의 형질을 전환시킨후 인터페론 생성기능을 가진 균주로 한다. 배양액에는 적당한 항생물질을 가한다.

3.2 추출 및 정제

3.2.1 추출

인터페론 알파-2a를 발현시킨 대장균 또는 효모 배양액으로부터 산성화, 분쇄 혹은 원심분리방법 등으로 인터페론 알파-2a 추출물을 얻는다.

3.2.2 정제

삼염화초산침전법 등 적당한 방법을 이용한다.

3.3 원액

정제된 인터페론 알파-2a액을 원액이라 한다.

원액에는 3.4항의 시험 후 적당한 안정제를 넣을 수 있다.

3.4 원액의 시험

3.4.1 비활성시험

3.6.6항 역가시험에 따라 역가를 측정하고 단백질정량법(2)에 따라 총 단백질량을 측정하여 역가와 단백질량의 비를 산출하였을 때 단백질 1 mg중 인터페론 알파-2a는 1.3 × 108 국제단위 이상을 함유하여야 한다.

3.5 최종원액

원액에 적당하게 용제를 넣어 이를 최종원액으로 한다. 이때 적당한 안정제를 넣을 수 있다. 다만, 단백질을 안정제로 첨가하였을 때는 3.6.2항, 3.6.5항은 원액을 가지고 시험한다.

3.6 최종원액의 시험

3.6.1 항생제부정시험

적당한 방법으로 시험할 때 염산 테트라싸이클린이 들어있는 경우 함량은 0.25 □/mL 이하이어야 한다.

3.6.2 순도시험

3.6.5방법으로 측정하였을 때 총 단백질 함량 중 95 % 이상이 인터페론 알파-2a이어야 하며, 또한 단일 불순성분이 2 % 이하이어야 한다.

3.6.3 무균시험

무균시험법 (1) 및 (2)에 따르며, 이에 적합하여야 한다.

3.6.4 발열성 물질시험

5.5에 따라 시험할 때 이에 적합하여야 한다.

3.6.5 분자량시험

에스 디 에스-폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동법 등 적당한 방법에 의한 시험에서 분자량은 16000 ∼ 18500 달톤이어야 한다.

3.6.6 역가시험

항 바이러스 활성을 적당한 방법으로 측정할 때 상용표준 인터페론 알파-2a 역가보다 동등 또는 그 이상이어야 한다.

4. 분병과 용기

제제규칙 3. 분병과 용기항에 따르며, 동결건조후 질소가스를 충전하여 밀봉한다.

5. 검 정

5.1 함습도시험

함습도 측정법에 따르며 수분함량이 4 % 이하이어야 한다.

5.2 pH 측정시험

이 제제의 pH는 4.5 ∼ 6.5이어야 한다.

5.3 무균시험

무균시험법 (1)에 따르며 이에 적합하여야 한다.

5.4 이상독성부정시험

이상독성부정시험법 1 또는 2에 따르며, 이에 적합하여야 한다. 다만, 2법을 실시할 경우 다음의 방법을 사용할 수 있다.

17∼22 g의 건강한 마우스 5마리에 검체 0.5 mL 씩을 정맥주사하고 24시간 관찰한다. 관찰기간 중 어떤 마우스도 사망하지 않으면 적합하며 2마리 이상 사망하면 부적합한 것으로 한다. 단, 5마리 중 1마리가 사망하면 반복 시험하여 어떤 마우스도 사망하지 않을 경우 적합한 것으로 한다.

5.5 발열성물질시험

일반 시험법중 발열성물질시험법에 따르며 이에 적합하여야 한다. 다만, 검체의 양은 동물체중 kg 당 150만 국제단위로 한다.

5.6 동정시험

5.6.1 조직 배양법

조직배양에서 수포성 구내염 바이러스(VSV) 또는 마우스 뇌신근염(EMC)바이러스 활성의 억제가 확인되거나 또는 항 인터페론 알파-2a 혈청에 의해 항 바이러스 활성이 중화되어야 한다.

5.6.2 전기영동법

에스 디 에스-폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동으로 분자량을 확인한 후 염색된 건조겔을 가지고 계산하였을 때 95 % 이상 인터페론 알파-2a 단백질이어야 한다. 다만, 최종원액에 단백질을 안정제로 첨가하였을 때에는 생략한다.

5.7 역가시험

검체 및 표준품을 MDBK 등의 감수성있는 세포와 동량으로 배양한 후 세포단층이 형성되면 수포성 구내염 바이러스(VSV) 등의 공격바이러스를 가한다. 현미경으로 세포병변효과(CPE)의 진행이 확인되면 염색, 세척후 실온에서 건조한 다음 2-methoxyethanol 등으로 추출한 후 550 nm에서 각 웰에 대한 흡광도를 재서 항 바이러스 활성을 측정한다. 표준품과 비교하여 환산하였을때 검체역가는 표시역가의 70 ∼ 150 %이어야 한다.

6. 기 록

제제규칙 5. 기록항에 따른다.

7. 시공품

제제규칙 6. 시공품항에 따른다.

8. 용기 및 포장의 단위

용기 및 포장의 표시항에 따른다.

9. 운 송

제제규칙 8. 운송항에 따른다.

10. 유효기간

유효기간은 24 개월로 한다.

11. 용제의 첨부

주사용 건조 인터페론 알파-2b (유전자재조합)

Freeze-Dried Interferon Alfa-2b for Injection(rDNA)

1. 정 의

1.1 명칭

이 제제는 「주사용 건조 인터페론 알파-2b(유전자재조합)」라 한다.

1.2 제제

이 제제는 유전자 재조합으로 얻은 인터페론 알파-2b를 함유한 건조제제이다. 용제를 넣었을 때 무색, 백색 또는 엷은 황색의 액상제제이다.

2. 일반제조 기준

제제규칙 2. 생산관리항에 따른다.

3. 제조기준

3.1 재료

3.1.1 제조용균주

제조용 균주는 사람의 백혈구로부터 분리된 인터페론 알파-2b 생성유전자 또는 유전자 합성기로 합성한 인터페론 알파-2b 생성유전자를 플라즈미드 등 벡터를 이용하여 대장균, 슈도모나스균 등의 형질을 전환시킨 후 인터페론 생성기능을 가진 균주로 한다. 배양액에는 적당한 항생물질을 가한다.

3.2 추출 및 정제

3.2.1 추출

인터페론알파-2b를 발현시킨 대장균 또는 슈도모나스 배양액으로부터 산성화, 분쇄 혹은 원심분리방법 등으로 인터페론 알파-2b 추출물을 얻는다.

3.2.2 정제

삼염화초산침전법 등 적당한 방법을 이용한다.

3.3 원액

정제된 인터페론 알파-2b액을 원액이라 한다.

원액에는 3.4항의 시험 후 적당한 안정제를 넣을 수 있다.

3.4 원액의 시험

3.4.1 비활성시험

3.6.6항 역가시험에 따라 역가를 측정하고 단백질 정량법(2)에 따라 총 단백질량을 측정하여 역가와 단백질량의 비를 산출하였을 때 단백질 1 mg중 인터페론 알파-2b는 1.3 × 108 국제단위 이상을 함유하여야 한다.

3.5 최종원액

원액에 적당하게 용제를 넣어 이를 최종원액으로 한다. 이때, 적당한 안정제를 넣을 수 있다. 다만, 단백질을 안정제로 첨가하였을 때는 3.6.2항, 3.6.5항은 원액을 가지고 시험한다.

3.6 최종원액의 시험

3.6.1 항생제부정시험

적당한 방법으로 시험할 때 염산테트라싸이클린이 들어있는 경우 함량은 0.25 □/mL 이하이어야 한다.

3.6.2 순도시험

3.6.5 방법으로 측정하였을 때 총 단백질 함량중 95 % 이상이 인터페론 알파-2b이어야하며, 또한 단일불순성분이 2 % 이하이어야 한다.

3.6.3 무균시험

무균시험법 (1) 및 (2)에 따르며, 이에 적합하여야 한다.

3.6.4 발열성물질시험

5.5에 따라 시험할 때 이에 적합하여야 한다.

3.6.5 분자량시험

에스 디 에스-폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동법 등 적당한 방법에 의한 시험에서 분자량은 17000 - 19500 달톤이어야 한다.

3.6.6 역가시험

항 바이러스 활성을 적당한 방법으로 측정할 때 상용표준 인터페론 알파-2b 역가보다 동등 또는 그 이상이어야 한다.

4. 분병과 용기

제제규칙 3. 분병과 용기항에 따르며, 동결건조 후 질소가스를 충전하여 밀봉한다.

5. 검 정

5.1 함습도시험

함습도 측정법에 따르며 수분함량이 4 % 이하이어야 한다.

5.2 pH측정시험

이 제제의 pH는 6.5 ∼ 8.0이어야 한다.

5.3 무균시험

무균시험법 (1)에 따르며 이에 적합하여야 한다.

5.4 이상독성 부정시험

이상독성부정시험법 1 또는 2에 따르며, 이에 적합하여야 한다. 다만, 2법을 실시할 경우 다음의 방법을 사용할 수 있다.

17∼22 g의 건강한 마우스 5마리에 검체 0.5 mL 씩을 정맥주사하고 24시간 관찰한다. 관찰기간 중 어떤 마우스도 사망하지 않으면 적합하며 2마리 이상 사망하면 부적합한 것으로 한다. 단, 5마리 중 1마리가 사망하면 반복 시험하여 어떤 마우스도 사망하지 않을 경우 적합한 것으로 한다.

5.5 발열성물질시험 또는 엔도톡신시험

일반 시험법중 발열성물질시험법 또는 엔도톡신시험법에 따르며 이에 적합하여야 한다. 이 때, 발열성물질시험법의 경우 검체의 양은 동물체중 kg 당 150만 국제단위로 하고, 엔도톡신시험법의 경우 그 기준은 60만 국제단위당 0.25 EU 미만이어야 한다. 다만, 재시험 결과 역시 규격치를 유의하게 초과할 경우에는 발열성 물질시험법을 적용한다.

5.6 동정시험

5.6.1 조직배양법

조직배양에서 수포성 구내염 바이러스(VSV) 또는 마우스 뇌신근염(EMC) 바이러스 활성의 억제가 확인되거나 또는 항 인터페론 알파-2b 혈청에 의해 항 바이러스 활성이 중화되어야 한다.

5.6.2 전기영동법

에스 디 에스-폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동으로 분자량을 확인한 후 염색된 건조겔을 가지고 계산하였을 때 95 % 이상 인터페론 알파-2b 단백질이어야 한다. 다만, 최종원액에 단백질을 안정제로 첨가하였을 때에는 생략한다.

5.7 역가시험

검체 및 표준품을 MDBK 등의 감수성있는 세포와 동량으로 배양한 후 세포단층이 형성되면 수포성 구내염 바이러스(VSV) 등의 공격바이러스를 가한다. 현미경으로 세포병변효과(CPE)의 진행이 확인되면 염색, 세척후 실온에서 건조한 다음 2-methoxyethanol 등으로 추출한 후 550 nm에서 각 웰에 대한 흡광도를 재서 항 바이러스 활성을 측정한다. 표준품과 비교하여 환산하였을 때 검체역가는 표시역가의 70 ∼ 150 %이어야 한다.

6. 기 록

제제규칙 5. 기록항에 따른다.

7. 시공품

제제규칙 6. 시공품항에 따른다.

8. 용기 및 포장의 단위

용기 및 포장의 표시항에 따른다.

9. 운 송

제제규칙 8. 운송항에 따른다.

10. 유효기간

유효기간은 24 개월로 한다.

11. 용제의 첨부

주사용 건조 인터페론 감마(유전자재조합)

Freeze-Dried Interferon Gamma for Injection(rDNA)

1. 정 의

1.1 명칭

이 제제는 「주사용 건조 인터페론 감마(유전자재조합)」라 한다.

1.2 제제

이 제제는 재조합 DNA 기술을 응용하여 제조된 인터페론 감마를 함유한 건조제제이다. 용제를 넣었을 때 무색투명한 액상제제이다.

2. 일반제조 기준

제제규칙 2. 생산관리항에 따른다.

3. 제조기준

3.1 재료

3.1.1 제조용 균주

제조용 균주는 사람 인터페론 감마를 암호화하는 유전자를 합성하여 적절한 플라즈미드에 재조합한 다음 이것을 벡터로 하여 효모의 형질을 전환시킨 후 인터페론 감마 산생기능을 가진 효모균으로 한다.

3.1.2 배양액

재조합체 효모의 배양에 적합한 조성의 배양액을 사용한다.

3.2 추출 및 정제

3.2.1 추출

배양된 균체를 세포파괴기 등 적당한 방법을 이용하여 균체를 파괴하여 인터페론 감마 추출물을 얻는다.

3.2.2 정제

이온교환 크로마토그래프, 겔 여과 크로마토그래프 등 적당한 방법을 이용한다.

3.3 원액

정제된 인터페론 감마액을 원액이라 한다.

원액에는 3.4항의 시험 후 적당한 안정제를 넣을 수 있다.

3.4 원액의 시험

3.4.1 비활성시험

3.6.1항 역가시험에 따라 역가를 측정하고 단백질정량법(2)에 따라 총 단백질량을 측정하여 역가와 단백질량의 비를 산출하였을 때 단백질 1 mg중 인터페론 감마는 1000 만 국제단위 이상 함유하여야 한다.

3.4.2 효모단백질부정시험

항 효모 단백질 항체를 이용하여 적당한 방법으로 시험할 때 효모로부터 유래된 단백질이 확인되어서는 안된다.

3.4.3 아미노산조성비시험

저분자 성분을 제외하고, 얻어지는 단백질 성분을 가수분해하여 아미노산을 분석할 때, 16 종의 아미노산이 검출되고, 특정한 아미노산 조성은 정해진 범위내에 있어야 한다.

3.4.4 무균시험

무균시험법 (1) 및 (2)에 따르며, 이에 적합하여야 한다.

3.4.5 발열성물질시험

발열성물질시험법에 따르며, 이에 적합하여야 한다. 다만 검체의 양은 동물체중 kg 당 100 만 국제단위로 한다.

3.4.6 분자량시험

에스 디 에스-폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동법 등 적당한 방법에 의한 시험에서 분자량은 16000 ∼ 19200 달톤이어야 한다.

3.4.7 순도시험

에스 디 에스-폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동법 등 적당한 방법에 의한 시험에서 총 단백질 함량중 95 % 이상이 인터페론 감마이어야 한다. 또한, 단일불순성분이 2 % 이하이어야 한다.

3.5 최종원액

원액을 적당하게 혼합하고 이를 최종원액으로 한다.

이때 적당한 안정제를 넣을 수 있다.

3.6 최종원액의 시험

3.6.1 역가시험

항 바이러스 활성을 적당한 방법으로 측정하여 표준 인터페론 감마에 의해 국제단위로 환산한다. 통계학적으로 처리하였을 때 역가는 표시역가와 동등하여야 한다.

4. 분병과 용기

제제규칙 3. 분병과 용기항에 따른다.

5. 검 정

5.1 함습도시험

함습도측정법에 따르며, 3 % 이하이어야 한다.

5.2 pH 측정시험

이 제제의 pH는 6.0 ∼ 7.5이어야 한다.

5.3 무균시험

무균시험법 (1)에 따르며, 이에 적합하여야 한다.

5.4 이상독성부정시험

이상독성부정시험법 (2)에 따르며, 이에 적합하여야 한다.

5.5 발열성물질시험

발열성물질시험법에 따르며, 이에 적합하여야 한다. 다만, 검체의 양은 동물체중 kg 당 100 만 국제단위로 한다.

5.6 동정시험

인터페론 감마 항 혈청에 의하여 항 바이러스 활성이 중화되어야 한다.

5.7 역가시험

검체 및 표준품을 Hep-2 등의 감수성있는 세포와 동량으로 배양한 후 세포단층이 형성되면 수포성 구내염 바이러스(VSV) 등의 공격바이러스를 가한다. 현미경으로 세포병변효과(CPE)의 진행이 확인되면 염색, 세척후 실온에서 건조한 다음 2-methoxyethanol 등으로 추출한 후 550 nm에서 각 웰에 대한 흡광도를 재서 항 바이러스 활성을 측정한다. 표준품과 비교하여 환산하였을때 검체역가는 표시역가의 70 ∼ 150 %이어야 한다.

6. 기 록

제제규칙 5. 기록항에 따른다.

7. 시공품

제제규칙 6. 시공품항에 따른다.

8. 용기 및 포장의 단위

제제규칙 7. 용기 및 포장의 표시항에 따른다.

9. 운 송

제제규칙 8. 운송항에 따른다.

10. 저장과 유효기간

유효기간은 13 개월로 한다.

11. 용제의 첨부

인터페론 알파-2b 주사액(유전자재조합)

Interferon Alfa-2b Injection(rDNA)

1. 정    의

1.1 명칭

이 제제는 「인터페론 알파-2b 주사액(유전자재조합)」이라 한다.

1.2 제제

이 제제는 유전자재조합으로 얻은 인터페론 알파-2b를 함유하는 맑은 무색의 액상제제이다.

2. 일반제조 기준

제제규칙 2. 생산관리항에 따른다.

3. 제조기준

3.1 재료

3.1.1 제조용 균주

제조용 균주는 사람의 백혈구로부터 분리된 인터페론 알파-2b 생성유전자를 플라스미드 등 벡터를 이용하여 대장균의 형질을 전환시킨 후 인터페론 생성기능을 가진 균주로 한다. 배양액에는 적당한 항생물질을 가한다.

3.2 추출 및 정제

3.2.1 추출

인터페론 알파-2b를 발현시킨 대장균으로부터 산성화, 침전, 여과 또는 원심분리 방법 등으로 인터페론 알파-2b 추출물을 얻는다.

3.2.2 정제

원심분리와 크로마토그래프법 등을 이용하여 정제한다.

3.3 원액

정제된 인터페론 알파-2b액을 원액이라 한다.

원액에는 3.4의 시험 후 적당한 부형제를 넣을 수 있다.

3.4 원액의 시험

3.4.1 비활성시험

3.4.5에 따라 역가를 측정하고 액체크로마토그래프법 또는 단백질정량법(2)에 따라 단백질량을 측정하여 역가와 단백질량의 비를 산출할 때, 비활성은 단백질 1 mg 당 1.5 × 108 ∼ 3.3 × 108 국제단위이어야 한다.

3.4.2 항생물질 부정시험

적당한 방법으로 시험할 때 염산 테트라싸이클린이 들어있는 경우 함량은 0.125 □/mL 이하이어야 한다.

3.4.3 동정시험

3.4.3.1 조직배양법

3.4.5에 따라 시험할 때 수포성 구내염 바이러스(VSV) 등의 활성억제가 확인되어야 한다.

3.4.3.2 전기영동법

에스디에스-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 분자량을 확인할 때 검체의 주밴드의 위치는 표준품의 주밴드와 같아야 한다.

3.4.3.3 등전점

적당한 방법으로 시험할 때 등전점이 표준품의 0.2 pI 단위 이내이어야 한다.

3.4.3.4 펩타이드 지도

적당한 방법으로 시험할 때 검액의 크로마토그램은 표준품과 동등하여야 한다.

3.4.4 순도시험

3.4.4.1 전기영동법(환원조건)

3.4.3.2에 따라 시험할 때 총 불순물의 양은 2 % 이하, 각각의 불순물은 1 % 이하이어야 한다.

3.4.4.2 전기영동법(비환원조건)

3.4.3.2에 따라 시험할 때 총 불순물의 양은 2 % 이하, 각각의 불순물은 1 % 이하, 이합체(dimer)는 1 % 이하이어야 한다.

3.4.4.3 숙주유래 단백질 시험

적당한 방법으로 시험할 때 E. coli 단백질은 총 단백질량의 0.02 % 이하이어야 한다.

3.4.4.4 등전집속법

3.4.3.3에 따라 시험할 때 데스아미도류가 나타나서는 안된다.

3.4.4.5 유연물질

적당한 방법으로 시험할 때 각각의 유연물질은 전체의 3.0 % 이하이고 그 합은 전체의 5.0 % 이하이어야 한다.

3.4.4.6 숙주유래 DNA 시험

Hybridization 등의 적당한 방법으로 시험할 때 총 DNA 함량이 80 pg/mg 단백질 이하이어야 한다.

3.4.4.7 N-말단 메치오닌 시험

생산과정 중 N-말단에 메치오닐 유도체가 생성되는 경우, 적당한 방법으로 시험할 때 N-말단 메치오닌은 10 % 이하이어야 한다.

3.4.5 역가시험

적당한 방법으로 항바이러스 활성을 측정할 때 1 mL 당 2 × 108 국제단위 이상이어야 한다.

3.4.6 발열성물질시험 또는 엔도톡신시험

5.4에 따라 시험할 때 이에 적합하여야 한다.

3.5 최종원액

원액에 적당한 부형제를 넣어 최종원액으로 한다.

3.6 최종원액의 시험

3.6.1 pH측정시험

pH측정법에 따라 시험할 때 6.6 ∼ 7.0이어야 한다.

3.6.2 무균시험

무균시험법 1, 2에 따라 시험할 때 이에 적합하여야 한다.

4. 분병과 용기

제제규칙 3. 분병과 용기항에 따른다.

5. 검    정

5.1 pH측정시험

이 제제의 pH는 6.5 ∼ 8.0이어야 한다.

5.2 무균시험

무균시험법 1에 따라 시험할 때 이에 적합하여야 한다.

5.3 이상독성 부정시험

이상독성부정시험법 1 또는 2에 따르며, 이에 적합하여야 한다. 다만, 2법을 실시할 경우 다음의 방법을 사용할 수 있다.

17∼22 g의 건강한 마우스 5마리에 검체 0.5 mL 씩을 정맥주사하고 24시간 관찰한다. 관찰기간 중 어떤 마우스도 사망하지 않으면 적합하며 2마리 이상 사망하면 부적합한 것으로 한다. 단, 5마리 중 1마리가 사망하면 반복 시험하여 어떤 마우스도 사망하지 않을 경우 적합한 것으로 한다.

5.4 발열성물질시험 또는 엔도톡신시험

일반시험법 중 발열성물질시험법 또는 엔도톡신시험법에 따르며 이에 적합하여야 한다. 이 때, 발열성물질시험법의 경우 검체의 양은 동물 체중 kg 당 150만 국제단위로 하고, 엔도톡신시험법의 경우 그 기준은 60만 국제단위 당 0.25 E.U. 미만이어야 한다. 다만, 재시험 결과 역시 규격치를 유의하게 초과할 경우에는 발열성물질시험법을 적용한다.

5.5 동정시험

다음의 1, 2 또는 3에 따라 시험한다.

5.5.1 조직배양법

5.6에 따라 시험할 때 수포성 구내염 바이러스(VSV) 등의 활성억제가 확인되어야 한다.

5.5.2 전기영동법

5.5.2.1 에스디에스-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법(환원조건)

적당한 방법으로 시험할 때 총 불순물은 2.5 % 이하이어야 한다.

5.5.2.2 에스디에스-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법(비환원조건)

적당한 방법으로 시험할 때 총 불순물은 2.5 % 이하이어야 한다.

5.5.3 역상 HPLC법

역상 HPLC법에 따라 시험할 때 검액 피크의 유지시간 및 피크 모양이 표준품과 동일해야 한다.

5.6 역가시험

주사용 건조 인터페론 알파-2b(유전자재조합) 5.7항에 따른다.

5.7 보존제 시험

5.7.1 동정시험

5.7.2에 따라 시험할 때 m-크레솔이 들어있는 경우, 검액 피크의 유지시간 및 피크 모양이 표준품과 동등해야 한다.

5.7.2 함량시험

m-크레솔이 들어있는 경우, 검체를 0.1 % TFA 메탄올용액으로 25배 희석하여 검액으로 하고, 수소염이온화검출기와 80/100 Carbopack C/0.1 % SP-1000으로 충진된 칼럼 또는 이와 동등한 것을 사용한 질소 가스크로마토그래프법으로 표준액과 함께 시험하였을 때 m-크레솔의 함량은 표시량의 80 ∼ 110 %이어야 한다.

6. 기    록

제제규칙 5. 기록항에 따른다.

7. 시 공 품

제제규칙 6. 시공품항에 따른다.

8. 용기 및 포장의 표시

제제규칙 7. 용기 및 포장의 표시항에 따른다.

9. 운    송

제제규칙 8. 운송항에 따른다.

10. 유효기간

유효기간은 12개월로 한다.

부  칙

①(시행일) 이 고시는 고시한 날부터 시행한다.

②(경과조치) 종전의 고시에 의하여 제조된 생물학적제제의 국가검정은 종전의 고시에 따른다.